Group-specific primer designGroup-s

Group-specific primer design
Group-specific primers were designed by obtaining 16S
rRNA sequences from GenBank (Benson et al. 2002)
corresponding to 30 taxonomically diverse crustaceans,
3 fishes, 2 echinoderms and 2 cephalopods (one of them
O. vulgaris), which are known to be present in the NE
Atlantic Ocean (Table 5, supplementary material). These
sequences were then aligned with MAFFT (Katoh et al.
2002). The software AMPLICON (Jarman 2004) was used
to identify conserved regions within the target group of
potential prey species, but with nucleotide mismatches at
the 30 end of the O. vulgaris forward primer sequence to
prevent its amplification (Deagle et al. 2007). Group-specific
primer specificity was tested by PCRusing a gradient between
49 and 60 C on known template DNA from across the
Crustacea (the euphausiacid Nyctiphanes couchii, the crab
Necora puber, the squat lobster Galathea strigosa, the hermit
crab Anapagurus laevis, the prawn Palaemon longirostris,
the mysid Leptomysis gracilis and the copepod Calanus
helgolandicus), Chaetognata (Sagitta elegans) and O. vulgaris
(Table 1).
Genetic database of planktonic organisms
from the Rı´a de Vigo
To ensure the correct identification of sequences obtained
fromthe gut of O. vulgaris paralarvae, mtDNA16S sequences
were obtained from25 species of crustaceans collected in the
zooplankton sampling done in the Rı´a de Vigo (Table 2). One
individual of each species was visually identified and washed
with distilled water to remove surface contaminants, and
DNA was extracted with the QIAamp DNA Micro Kit
(QIAGEN), eluting the DNA in ultrapure water.
Due to difficulties amplifying crustacean 16S rRNA,
PCR products were generated with different combinations
of the universal primers 16Sar-16Sbr (Simon et al. 1994)
and the designed group-specific primers 16Scruf-16Scrur
(Table 2). Copepod-specific primers 16Sca and 16Scb
(Braga et al. 1999) were needed to amplify a region
that is nested in the 16S rRNA universal fragment and
encompasses the sequence amplified with the designed
group-specific primers. Cycling conditions for the primers
16Sar-16Scrur and 16Scruf-16Sbr consisted of an initial
denaturation at 94 C for 2 min followed by 39 cycles of:
denaturation at 94 C for 30 s, annealing at 57 C for 35 s,
extension at 72 C for 40 s and a final step of 7 min at
72 C. Cycling conditions for copepod primers 16Sca-
16Scb consisted of an initial denaturation at 94 C for
2 min followed by 38 cycles of: denaturation at 94 C for
60 s, annealing at 50 C for 60 s, extension at 72 C
for 60 s and a final step of 7 min at 72 C.
All reactions were carried out in 25 lL, containing
10–100 ng of template, 2.5 lL 109 PCR buffer, 0.5 lL
dNTPs, 0.75 lL each primer and 0.025 U lL-1 Taq
polymerase (Roche). PCR amplifications were carried out
in a TGradient thermocycler (Biometra). Aerosol-resistant

결과 (한국어) 1:

첫 번째 그룹 전용 디자인그룹-특정 뇌관 16S 취득에 의해 설계 되었습니다.은행 (벤슨 외. 2002)에서 rRNA 순서해당 30 taxonomically 다양 한 갑각류, 하3 물고기, 2 echinoderms 및 cephalopods (그들 중 하나 2O. vulgaris), NE에 알려져 있습니다대서양 (표 5, 보충 자료) 이러한MAFFT 시퀀스 다음 정렬 했다 (Katoh 외에는.)2002 년).는 AMPLICON (Jarman 2004) 소프트웨어 사용대상 그룹 내에서 보존된 영역을 식별 하잠재적인 먹이 종, 그러나 뉴클레오티드에 불일치o. vulgaris 첫번째 앞으로 시퀀스의 30 끝그 증폭 (Deagle 외. 2007)을 방지 합니다. 그룹 관련첫 번째 특이성 사이 기온 변화도를 PCRusing에 의해 테스트 되었습니다.49와 60 C 건너편에서 알려진된 서식 파일 DNA에는Crustacea (euphausiacid Nyctiphanes couchii, 게)Puber, 쪼 그리고 랍스터 Galathea strigosa, 은둔 게Anapagurus laevis, Palaemon longirostris, 새우 게Mysid Leptomysis gracilis와 copepod Calanushelgolandicus), Chaetognata (Sagitta 선 충)와 o. vulgaris(표 1)입니다.Planktonic 생물의 유전자 데이터베이스비고의 Rı´a에서얻은 시퀀스의 올바른 식별을 보장 하기 위해o. vulgaris paralarvae, mtDNA16S 시퀀스의 용기에서가져온 from25 종의 갑각류에 수집 된동물성 플 랭크 톤 샘플링 비고 (표 2)의 Rı´a에서. 하나각 종족의 개인 시각 식별 및 세척와 증류수, 표면 오염 물질을 제거 하 고QIAamp DNA 마이크로 키트와 함께 DNA 추출 된(QIAGEN) 초순에 DNA를 방출.갑각류 16S를 증폭 하는 어려움 때문 rRNA,PCR 제품 다른 조합으로 생성 된보편적인 뇌관 16Sar-16Sbr (Simon 외., 1994)의그리고 디자인된 그룹-특정 뇌관 16Scruf-16Scrur(표 2)입니다. Copepod 특정 뇌관 16Sca 및 16Scb(브라 외. 1999) 영역을 증폭 하는 데 필요한 했다16S rRNA 보편적인 조각에 중첩 하 고시퀀스는 설계와 증폭을 포함그룹 특정 한 뇌관 사이클링 뇌관에 대 한 조건16Sar-16Scrur와 16Scruf-16Sbr는 초기의 구성2 분 동안 94 C에서 변성의 39 주기 다음:변성 94 C 30에서 35 57 C에서 어 닐 링 s s,40 초 동안에 7 분의 마지막 단계로 72 C에서 확장Copepod 프라이 머 16Sca-72 C. 사이클링 조건16Scb 94 C에서 초기 변성의 구성2 분 뒤의 38 주기: 94 C에서 변성60 60 50 C에서 어 닐 링 s s, 72 C에서 확장60 s 72 c에서 7 분의 마지막 단계를모든 반응 25에서 실시 했다 lL, 포함서식 파일의 10-100, 2.5 lL 109 PCR 버퍼, 0.5 lLdNTPs, 0.75 lL 처음 각 및 0.025 U lL-1 Taq중 합 효소 (로슈)입니다. PCR 확대 실시 했다TGradient thermocycler (Biometra). 에 어로 졸 방지

결과 (한국어) 2:

그룹 별 디자인 첫 번째
그룹 별 프라이머 16S 얻기에 의해 설계되었습니다
의 GenBank에서 rRNA의 서열을 (벤슨 등. 2002)
(30) 분류 학적으로 다양한 갑각류에 해당하는,
물고기 3, 2, 2 두족류의 극피 동물 (그들 중 하나
O. 심상), 어떤 알려진 NE에 존재하는
대서양 (표 5, 보충 자료). 이들은
다음 MAFFT으로 순서를 정렬 되었는가 (Katoh 등.
2002). 소프트웨어의 증폭 (2004 저먼는) 사용
의 대상 그룹 내에서 정체성 보존 지역을 식별하는
잠재적 인 먹이 종, 만에 염기 불일치
O를 앞으로 vulgaris의 첫 번째 시퀀스의 30 끝
방지 성병 증폭 (외. 2007 Deagle). 그룹 별
최초의 특이도 사이에 그라데이션 PCRusing에 의해 테스트 된
49, 60? C 전역에서 알려진 주형 DNA에
갑각류 (euphausiacid Nyctiphanes의 couchii, 게
벨벳 게, 스쿼트 랍스터 Galathea의 strigosa, 은둔
게 Anapagurus의 laevis의, 새우 Palaemon longirostris,
mysid Leptomysis 박근 및 요각류 Calanus의
helgolandicus) Chaetognata (화살 엘레) 및 O 심상
(표 1).
플랑크톤 생물의 유전자 데이터베이스
비고 Ri'a에서이
획득 시퀀스의 정확한 식별을 보장하기 위해
장 에서요 -을 O. 심상의 paralarvae는 mtDNA16S 시퀀스
에서 갑각류의 수집 종을 얻었다 from25
Ri'a 비고 (표 2)에서 수행 동물 플랑크톤 샘플링. 한
각 종의 단일의 시각적 식별 세정
표면 오염물을 제거하고 증류수로하고
DNA가 QIAamp DNA 마이크로 키트로 추출 하였다
초순수에 DNA 용출 (QIAGEN).
인해 어려움이 16S rRNA의 증폭 갑각류
PCR 제품이 있었 다른 조합으로 생성 된
범용 프라이머 16Sar-16Sbr (사이먼 등의 등. 1994)
과 16Scruf-16Scrur 디자인 그룹 별 프라이머
(표 2). 16Sca의 요각류 특이 적 프라이머 및 16Scb
(브라 등. 1999) 영역 증폭 필요했다
16S rRNA의 보편적 인 조각에 중첩되고,
함께 설계 증폭 시퀀스 포함
그룹 특정 프라이머. 프라이머에 대한 사이클링 조건
16Sar-16Scrur과 16Scruf-16Sbr 초기 구성
: 39주기 다음 2 분 동안 94 ℃에서 변성
(35)의,? 57 ℃에서 30 초 동안 94 ℃에서 변성, 어닐링
에서 확장 72 내지 40 초 동안 및 C에서 7 분의 마지막 단계
(72)? C. 요각류 프라이머에 대한 사이클링 조건은 16Sca-
? 16Scb은 94 ℃에서 초기 변성 구성
94 ℃에서 변성 : 38 사이클 뒤에 2 분
72 ℃에서 60 초, 연장 50 ℃에서 60 초, 어닐링?
에 대한 60 초, 72? ℃에서 7 분의 마지막 단계
모든 반응 용기 함유 25 LL을 실시 하였다
템플릿 10-100 NG 2.5 LL 109 PCR 완충액 0.5 LL
의 dNTPs를 0.75 LL 각각 제 0.025 U LL 1 DNA 형성 촉매
중합 효소 (로슈). PCR 증폭을 수행 하였다
TGradient의 열 순환기 (Biometra)에서. 에어로졸 방지